Актуальность

Желудочно-кишечный тракт человека (ЖКТ) содержит сложную и динамичную популяцию микроорганизмов, кишечную микробиоту, которая оказывает заметное влияние на организм хозяина во время гомеостаза и болезни. Слизистая оболочка кишечника обеспечивает селективный проницаемый барьер для усвоения питательных веществ и защиты от внешних факторов. Он состоит из эпителиальных клеток, иммунных клеток и их секрета. Микробиота кишечника участвует в регулировании целостности и функции кишечного барьера в гомеостатическом балансе. Множество факторов способствуют формированию микробиоты кишечника человека в младенчестве. Диета считается одним из основных факторов формирования микробиоты кишечника на протяжении всей жизни. Патогенные микроорганизмы, ксенобиотики и пища могут нарушать кишечный барьер, способствуя системному воспалению и повреждению тканей. Генетические и иммунные факторы предрасполагают людей к дисфункции кишечного барьера, и изменения в составе и функции кишечной микробиоты играют центральную роль в этом процессе. Прогрессирующая идентификация этих изменений привела к развитию концепций «синдрома дырявого кишечника» и «дисбактериоза кишечника», которые лежат в основе взаимосвязи между нарушением кишечного барьера, метаболическими заболеваниями и аутоиммунитетом.

Дисбиоз—понятие более широкое, включающее в себя наличие изменений со стороны не только бактериального состава микроорганизмов, но и вирусов, простейших, грибов. Кроме того, понятие дисбиоза применяется для обозначения нарушений состава микробиоты в разных биотопах организма человека, а также механизмов их взаимодействия [1]. Впервые термин «дисбактериоз» был введен в 1916 году A. Nissle, который под дисбактериозом первоначально понимал изменения, касающиеся только кишечной палочки. До настоящего времени широко использовалось и другое определение дисбактериоза как состояния, характеризующегося нарушением подвижного равновесия кишечной микробиоты и возникновением качественных и количественных изменений в микробном пейзаже кишечника [2]. Термин «Disbiosis» в настоящее время используется повсеместно в научной литературе, но чаще всего его ассоциируют с функциональной дисфункцией пищеварительного тракта.

Некоторыми авторами [3,4,5] дисбактериоз (не только кишечника, но и других нестерильных полостей и трактов) рассматривался как изменение микробиоценозов различных биотопов человеческого организма, выражающееся в нарушении инфраструктурного отношения «анаэробы/аэробы», популяционных изменениях численности и состава микробных видов биотопов, в том числе появлении нерезидентных для данного биотопа видов (контаминация, транслокация), изменении их метаболической активности  и являющееся следствием и/или одним из патогенетических механизмов различных патологических состояний.

В Российском отраслевом стандарте «Протокол ведения больных. "Дисбактериоз кишечника"» [6] под дисбактериозом кишечника понимают клинико-лабораторный синдром, связанный с изменением качественного и/или количественного состава микробиоты кишечника с последующим развитием метаболических и иммунологических нарушений с возможным развитием желудочно-кишечных расстройств.

За рубежом для обозначения проблем дисбиоза кишечника чаще используют другие термины, например «антибиотик-ассоциированная диарея» или «синдром интестинального избыточного микробного роста» [7].  Согласно данным Motamedi H. [8], распространенность таких бактерий, как Clostridioides (Clostridium) difficile, Clostridium perfringens, Klebsiella oxytoca и Staphylococcus aureus, связанных с антибиотик-ассоциированной диареей, была выявлена среди госпитализированных пациентов в 19,6%, 14,9%, 27% и 5,2% случаях соответственно. При объединении всех исследований распространенность Clostridioides (Clostridium) difficile, Clostridium perfringens, Klebsiella oxytoca и Staphylococcus aureus как бактерий, связанных с AAD, среди госпитализированных пациентов составила 19,6%, 14,9%, 27% и 5,2% соответственно.

When all studies were pooled, the prevalence of Clostridioides (Clostridium) difficile, Clostridium perfringens, Klebsiella oxytoca, and Staphylococcus aureus as bacteria associated with AAD among hospitalized patients was 19.6%, 14.9%, 27%, and 5.2%, respectively.

При объединении всех исследований распространенность Clostridioides (Clostridium) difficile, Clostridium perfringens, Klebsiella oxytoca и Staphylococcus aureus в качестве бактерий, связанных с ААД, среди госпитализированных пациентов составила 19,6%, 14,9%, 27% и 5,2% соответственно.

When all studies were pooled, the prevalence of Clostridioides (Clostridium) difficile, Clostridium perfringens, Klebsiella oxytoca, and Staphylococcus aureus as AAD-associated bacteria among hospitalized patients was 19.6%, 14.9%, 27%, and 5.2%, respectively.

Не удалось загрузить все результаты.

Повторить

Повторная попытка…

Распространенность всех четырех бактерий была выше в Европе по сравнению с другими континентами.

В современных динамично изменяющихся условиях жизни клиницистам и практикующим врачам необходимо учитывать изменения микробиоценоза разных биотопов организма человека при заболеваниях различной этиологии для проведения комплексных диагностических мероприятий при постановке диагноза и последующего лечения.

Целью исследования явился анализ причин и эффективных методов диагностики дисбиоза кишечника на основе анализа данных литературы.

Задачи исследования:

• Проанализировать причины возникновения кишечного дисбиоза на основании оценки данных литературы последних 15 лет.
• Оценить эффективные методы диагностики дисбиоза кишечника на основе анализа данных литературы последних 15 лет.

Материал и методы исследования

Был проведен обзор отечественной и зарубежной литературы по теме работы: «Причины и эффективные методы диагностики дисбиоза кишечника». Поиск публикаций проводился в электронных базах данных: PubMed, Google Search и eLIBRARY с 2008 по 2023 год. Поиск соответствующих исследований выполнялся по расширенному перечню ключевых слов: «кишечная микробиота», «дисбиоз кишечника», «причины дисбиоза кишечника», «методы диагностики дисбиоза кишечника». Было найдено 985 статей, включая метаанализы, оригинальные исследования, клинические испытания, литературные обзоры. После чего просматривали названия публикаций, аннотации и полнотекстовые статьи. В конечном итоге нами было отобрано 73 публикаций для написания литературного обзора. Дополнительно анализировали источники, включенные в список литературы выбранных статей.

Результаты и обсуждение

Несмотря на то, что кишечный дисбиоз не является заболеванием, а представляет собой синдромокомплекс, включающий в себя как разнообразные клинические проявления, так и лабораторно-инструментальные данные, влияние данного микробного дисбаланса велико и затрагивает все ткани и органы организма человека. Причины возникновения дисбактериоза включают в себя экзогенные факторы, оказывающие негативное воздействие на макроорганизм, например, климат, загрязнение окружающей среды, питание, бытовые, профессиональные и другие факторы. К наиболее важным факторам развития дисбактериоза относятся эндогенные, включающие в себя нерациональное и даже бесконтрольное использование антимикробных препаратов, физические и эмоциональные стрессы, голодание, а также различные инфекционные, соматические и психические заболевания человека. Как видно, дисбиоз может быть проявлением разных воздействий на человека, но как результат – приводит к исчезновению или снижению числа облигатных представителей нормобиоты с одной стороны и увеличению количества условно-патогенных микробов (энтеробактерий, стафилококков, грибов рода Candida и др.), которые в норме встречаются в незначительных количествах.

Древнее изречение «Все болезни начинаются в кишечнике», сформулированное Гиппократом в 3-м веке до н. э., в принципе, выдерживает современную научную проверку. Микробиом участвует в жизненно важных физиологических и иммунологических процессах, включая энергетический гомеостаз и обмен веществ, синтез витаминов и других питательных веществ, эндокринную сигнализацию, профилактику колонизации энтеропатогенов, регуляцию функции иммунной системы и метаболизм ксенобиотических соединений.  Действительно, многие желудочно-кишечные и системные заболевания были связаны с аберрантными микробными сообществами кишечника. Неясно, участвует ли микробиом непосредственно в патогенезе этих болезненных состояний. Тем не менее, растущее количество доказательств указывает на то, что это происходит посредством сложных взаимодействий между микробиомом, а также метаболической и иммунной системами хозяина. В обзоре будет рассмотрено текущее состояние знаний о роли кишечного микробиома в состояниях, влияющих на желудочно-кишечное и системное здоровье человека.TheprevalenceofallfourbacteriawashigherinEuropecomparedtoothercontinents.

Распространенность всех четырех бактерий в Европе была выше, чем на других континентах.

TheprevalenceofallfourbacteriainEuropewashigherthaninothercontinents.

Не удалось загрузить все результаты.

Повторить

Повторная попытка…

 

Дисбиоз кишечника и патологические состояния. Спектр клинических синдромов и патологических состояний, которые могут быть связаны с дисбиозом кишечника, достаточно широк и имеет тенденцию к увеличению. В настоящее время подтверждена взаимосвязь дисбиозов с заболеваниями практически всех систем организма человека: пищеварительной, иммунной, урогенитальной, дыхательной, кроветворной, сердечно-сосудистой, нервной, костно-мышечной [9,10].

Дисбиоз кишечника развивается большей частью вторично при различных соматических заболеваниях (язвенный колит, болезнь Крона, диффузный полипоз и распространенный дивертикулез толстой кишки и др.) [11,12,13]. Возникающие на фоне основного заболевания дисбиотические расстройства в толстой кишке долгое время могут не давать отчетливых клинических симптомов, протекают латентно, чем ухудшают диагностику, течение основного заболевания и результаты лечения [14].

Факторы, провоцирующие развитие дисбиоза кишечника, могут быть обусловлены возрастом, сезоном, особенностями питания, наличием онкологических заболеваний, острых и хронических инфекций, хронических заболеваний пищеварительной системы, приемом антибактериальных препаратов, радиоактивным облучением. [15,16].

Множество заболеваний, включая воспалительные заболевания кишечника, а также нарушения обмена веществ, такие как ожирение и диабет II-го типа, связаны с дисбиозом кишечника. Окислительный стресс, индукция бактериофагов и секреция бактериальных токсинов могут вызвать быстрые сдвиги среди кишечных микробных групп, что приводит к дисбактериозу. Исследования последних лет показали взаимосвязь изменений кишечного биоценоза и ожирения [17]. В результате избыточной микробной ферментации пищевых волокон и некоторых других субстратов в организм хозяина попадает небольшое количество дополнительной энергии, что может с течением времени способствовать увеличению веса. Кроме того, показано, что микробиота воздействует на гены, регулирующие расход и запасание энергии [18]. Понимание того, как кишечная микробиота влияет на связь между кишечником и мозгом, было предметом значительных исследований за последнее десятилетие. Расширение термина «ось микробиота-кишечник-мозг» с «оси кишечник-мозг» подчеркивает двунаправленную систему связи между кишечником и мозгом. Ось «микробиота-кишечник-мозг» включает метаболические, эндокринные, нервные и иммунные пути, которые имеют решающее значение для поддержания гомеостаза мозга. Изменения в составе кишечной микробиоты связаны с множественными нервно-психическими расстройствами. Хотя причинно-следственная связь между дисбактериозом кишечника и нервной дисфункцией остается неуловимой, новые данные указывают на то, что дисбиоз кишечника может способствовать агрегации бета-амилоида, нейровоспалению, окислительному стрессу и резистентности к инсулину в патогенезе болезни Альцгеймера (БА) [19]

В экспериментах на мышах  Xu Ketal показали, что ишемия головного мозга быстро индуцировала ишемию кишечника и производила избыточное количество нитратов в результате свободнорадикальных реакций, что приводило к дисбактериозу кишечника с распространением Enterobacteriaceae. Обогащение Enterobacteriaceae усугубляет инфаркт головного мозга за счет усиления системного воспаления и является независимым фактором риска первичного неблагоприятного исхода у пациентов с инсультом. Введение аминогуанидина или супероксиддисмутазы для снижения образования нитратов или введение вольфрамата для ингибирования дыхания нитратами приводило к подавлению разрастания энтеробактерий, уменьшению системного воспаления и уменьшению инфаркта головного мозга. Эти эффекты зависели от кишечного микробиома и указывали на поступательное значение оси «мозг-кишечник» при лечении инсульта [20].

Ось «кишечник-печень» относится к двунаправленным отношениям между кишечником и его микробиотой и печенью, возникающим в результате интеграции сигналов, генерируемых диетическими, генетическими факторами и факторами окружающей среды. Алкоголь нарушает ось «кишечник-печень» на нескольких взаимосвязанных уровнях, включая микробиом кишечника, слизистый барьер, эпителиальный барьер и на уровне выработки противомикробных пептидов, что увеличивает микробное воздействие и провоспалительную среду печени. Все больше данных указывают на патогенетическую роль метаболитов микробного происхождения, таких как триметиламин, вторичные желчные кислоты, короткоцепочечные жирные кислоты и этанол, в патогенезе неалкогольной жировой болезни печени [21]. Идентификация элементов оси «кишечник-печень», которые в первую очередь повреждаются при каждом хроническом заболевании печени, открывает возможности для вмешательства. Помимо антибиотиков, будущие методы лечения, ориентированные на кишечник, включают пробиотики нового поколения, бактериальные метаболиты (постбиотики), трансплантацию фекальных микробов и углеродные наночастицы.

Интересные данные были получены в работе Brugman, где показано положительное влияние антибиотиков на гликемический профиль крыс с предрасположенностью к сахарному диабету. У крыс без диабета также обнаружено достоверно более низкое содержание Bacteroidetes [22]. Предположительно, прием кишечных антисептиков приводит к снижению активности системного воспаления в ответ на уменьшение антигенной стимуляции, которое может способствовать деструкции β–клеток поджелудочной железы.

Известно, что в регуляции липидного обмена существенное значение имеет поддержание качественного и количественного состава микробиоты кишечника [23]. Нарушение кишечной микробиоты встречается у 90% больных с сердечно–сосудистыми заболеваниями [24]. Также избыточный бактериальный рост и транслокация кишечных микроорганизмов приводят к активации системного воспалительного ответа, прочно связанного с патогенезом хронической сердечной недостаточности (ХСН) [25].

Устойчивый дисбиоз кишечника способствует клинической манифестации иммунозависимых синдромов, в частности атопического и аутоиммунного. Есть данные об осложненном течении воспалительных (аутоиммунных) заболеваний кишечника в результате нарушения дифференцировки нативных Т-хелперов из-за нарушенной стимуляции последних дендритными клетками кишечника при дисбиозе [26,27]. Для больных неспецифическим язвенным колитом характерен дисбиоз со снижением количества бифидобактерий и лактобацилл, облигатной микробиоты и увеличением факультативных бактерий [28,29,30], при этом определяется дефицит защитного слоя муцинов [31].

При болезни Крона наблюдается нарушение микробиоценоза толстого кишечника за счет микобактерий, псевдомонад, иерсиний, патогенных штаммов эшерихий [32,33] с избытком слизеобразования.

Клинические последствия дисбиоза кишечника обусловлены, в первую очередь, утратой полезных свойств нормобиоты: она участвует в терминальном (толстокишечном) пищеварении, синтезирует биологически активные вещества, осуществляет колонизационную резистентность (сдерживает рост оппортунистической микробиоты) и вызывает позитивные иммуномодуляторные эффекты. Поэтому при определенной продолжительности дисбиоза возникает кишечная диспепсия (бродильная и гнилостная), метаболические нарушения, бактериальная и микотическая эндогенная интоксикация и сенсибилизация, отягощенное течение иммунодефицитных, аллергических и аутоиммунных синдромов.

Нарушение состава кишечной микробиоты способствует повреждению энтероцитов; повышению кишечной проницаемости для макромолекул; снижению защитных свойств слизистого барьера; созданию условий для развития патогенных микроорганизмов; нарушению физиологических процессов в кишечнике; изменению моторики кишечника.

Один из самых частых вариантов дисбиоза кишечника — кандидозный (согласно другой терминологии, «дисбиоз кишечника с избыточным ростом грибов рода Candida», или «неинвазивный кандидоз кишечника»). По данным Шевякова М.А. и соавт., доля кандидозного дисбиоза может достигать 31% [34]. Современные антибиотики отличаются высокой антибактериальной эффективностью и широким спектром антибактериального действия, однако не действуют на дрожжевые грибы и, более того, угнетают естественного антагониста грибов — резидентную микробиоту. В одной из последних работ, основанной на принципах доказательной медицины, показано, что рост дрожжеподобных грибов рода Candida в кишечнике статистически достоверно ассоциирован с увеличением частоты кандидозного вульвовагинита у женщин, пищевой аллергией и аллергическими заболеваниями вообще, а также с курением [35].

Лабораторная диагностика кишечного дисбиоза

К методам лабораторной диагностики относятся: прямые (выделение живой микробиоты из материала) и косвенные (определение продуктов, связанных с жизнедеятельностью микроорганизмов) — биохимические анализы кала, определение индола и скатола мочи, дыхательные тесты (водородный: тесты с 14С-гликохолатом или 14С c D-ксилозой), газовожидкостная хроматография фекалий или тонкокишечной жидкости [36].

В диагностике дисбиоза кишечника по-прежнему сохраняет значение «классический» бактериологический анализ. [37,38,39].  В результате многолетнего изучения кишечной микрофлоры Р.В. Эпштейн-Литвак и Ф.Л. Вильшанская (1970) разработали методы лабораторной  диагностики дисбактериоза  с исследованием фекалий в нарастающих разведениях, последующим посевом на бактериальные среды и количественным определением видового состава микрофлоры кишечника. [40].

Бактериологическое исследование на дисбиоз позволяет установить количественный и видовой состав микробиоты, обнаружить смену облигатной микробиоты на условно-патогенную и обосновать необходимость коррекции выявленных нарушений (с учетом степени дисбиоза, его этиологии и патогенеза, видового состава транзиторной микробиоты). Важно не только установить факт наличия дисбиоза, но и «вычленить» его клиническую составляющую в случае появления и нарастания клинических симптомов, усугубляющих симптоматику основного заболевания [41,42].

В литературе также имеются сообщения, подтверждающие низкую диагностическую ценность исследования кала на дисбактериоз [43,44,45].

В соответствии с Российским Отраслевым стандартом («Протокол ведения больных. Дисбактериоз кишечника» [6] микробиологическими критериями дисбактериоза кишечника считаются:

• нарастание количества условнопатогенных микроорганизмов одного или нескольких видов в кишечнике при нормальном количестве бифидобактерий;
• нарастание одного или нескольких видов условнопатогенных микроорганизмов при умеренном снижении концентрации бифидобактерий (на 1-2 порядка);
• снижение содержания облигатных представителей микробиоценоза (бифидобактерий и/или лактобацилл) без регистрируемого увеличения количества сапрофитной или условнопатогенной микробиоты кишечника;
• умеренное или значительное (меньше 10⁷) снижение содержания бифидобактерий, сочетающееся с выраженными изменениями в аэробной микробиоте — редукцией лактобацилл, появлением измененных форм кишечной палочки, обнаружением одного или нескольких представителей условнопатогенных микроорганизмов в высоких титрах (до 10⁷–10⁸ КОЕ/г).

Улучшение условий хранения и отбора проб может позволить культивировать прихотливые и чрезвычайно чувствительные бактерии. Прошлые и текущие исследования показали, что метод консервации сильно влияет на результаты, полученные культурально-зависимыми методами. Замораживание при температуре -20°C или -80°C используется для хранения образцов перед экспериментом. Замораживание при температуре -80°C, часто используемое для длительного хранения, считается золотым стандартом сохранения образцов с особым вниманием к холодовой цепи [46]. Для кратковременного хранения может быть достаточно охлаждения (4°C), а не хранения при комнатной температуре [47]. Было описано, что добавление защитных агентов, таких как дисахариды, полиолы и белки по отдельности [48] или, как показано в недавнем исследовании, в комбинации всего вышеперечисленного [49], повышает жизнеспособность бактерий в фекалиях после замораживания.

Залогом успеха в бактериологическом исследовании на дисбактериоз является эффективная питательная среда. Среда с дрожжевым экстрактом, гидролизатом казеина и жирными кислотами (ДЭГКЖК) представляет собой богатую среду, состоящую из факторов роста, антиоксидантов, летучих жирных кислот и витаминов. Поскольку микробиота кишечника человека состоит в основном из видов бактерий, не переносящих кислород, среда ДЭГКЖК должна быть особенно подходящей для культивирования этой микробиоты. Исследование Browne H Petal. показали, что большую часть бактерий кишечной микробиоты человека можно культивировать с использованием этой единственной среды. В этом исследовании было выделено 137 видов, среди которых 68 новых видов (63 Firmicutes, 4 Bacteroidetes и 1 Actinobacteria) [50,51].

Условия высокопродуктивного культивирования включали обогащение образцов во флаконах c питательной средой с добавлением овечьей крови [52]. Сочетание обогащения культуры с добавлением свежей среды привело к увеличению выделенных видов на 22% [53]. Кроме того, обогащение культуры улучшило глубину секвенирования ампликонов, а также метагеномики [54].

В последнее время быстрое развитие методов, основанных на анализе ГХ-МС (газовой хроматографии масс-спектрометрии), ЖХ-МС (жидкостной хроматографии масс-спектрометрии) и ВМС (визуализационной масс-спектрометрии), оказалось мощным для чувствительного и объективного обнаружения небольших молекулярных метаболитов и связанных с ними метаболических путей [55]. Комбинированное использование нескольких аналитических подходов способствует увеличению охвата метаболомом, обеспечивая чувствительные и надежные характеристики низкомолекулярных метаболитов, связанные с взаимодействием микробиоты кишечника и хозяина.

Метод быстрой ГХ с экстракцией подкисленной воды и методом прямого впрыска был разработан Zhao et al для определения короткоцепочечных жирных кислот в фекалиях человека, включая уксусную кислоту, пропионовую кислоту, масляную кислоту, валериановую кислоту, капроновую кислоту и гептановую кислоту. [56]. Для анализа неадекватно летучих или термонестабильных небольших молекулярных метаболитов в метаболоме были разработаны и использованы химические модификации или дериватизации небольших молекулярных метаболитов. В процессе дериватизации ГХ-МС можно использовать для анализа не только летучих и неполярных соединений, но и полярных соединений, таких как нейротрансмиттеры и полиненасыщенные жирные кислоты (ПНЖК), [57], амины [58] и аминокислоты [59].  ГХ-МС обладает уникальным преимуществом для идентификации неизвестных соединений путем поиска по библиотеке спектра. 

Жидкостная хроматография масс-спектрометрия широко используется в исследованиях метаболомики [60]. Объектами изучения в данном методе являются полярные соединения, нелетучие соединения и термонестабильные соединения. В зависимости от полярности соединений для анализа компонентов средней и высокой полярности использовали реверснофазную жидкостную хроматографию и гидрофильную интерактивную хроматографию  соответственно [61].  Жидкостная хроматография в сочетании с различными вариациями масс-спектрометрии подходила как для качественного, так и для количественного анализа. Массовые анализаторы в основном включают QQQ-MS, LTQ-MS, TOF-MS, QTOF-MS и Orbitrap-MS. Данная методика обеспечивает высокую чувствительность, точность, линейность и широкий динамический диапазон для определения небольших молекулярных метаболитов.

Визуализационная масс-спектрометрия была разработана и применена для анализа пространственного распределения химических композиций с их молекулярными массами, которая стала привлекательным инструментом метаболомики. Применение данной методики не требует предварительного знания анализируемых образцов и обеспечивает высокую пропускную способность профилирования небольших молекулярных метаболитов с точной массой, что отличается от широко используемых традиционных методологий визуализации, таких как радиохимия и иммуногистохимия. С помощью визуализационной масс-спектрометрии можно увидеть пространственное распределение молекулярных метаболитов, полученных из кишечных микробов. Для анализа небольших молекулярных метаболитов, были разработаны качественные и количественные методы визуализационной масс-спектрометрии, включая матричную лазерную десорбцию/ионизацию ВMS (MALDI-ВMС), десорбционную ионизацию электрораспылением ВMС (ДИЭР-ВMS) и ВMС с наноструктурой-инициатором [62].  MALDI-TOF ВMС в настоящее время, по-видимому, является одним из наиболее распространенных подходов ВMС, с его высоким диапазоном масс (до 500 кДа), пространственным разрешением 20 мкм и возможностью получения спектра MS/MS. Нецелевой метод MALDI-ВMС был применен для изучения биологической сложности взаимодействия микробиоты кишечника с хозяином. 

В дополнение к широкому использованию вышеуказанных методов масс- спектрометрии некоторые платформы также добились значительных успехов в метаболомике нейродегенеративных заболеваний, например, масс-спектрометрия с прямой или проточной инъекцией и капиллярный электрофорез-масс-спектрометрия [63]. Метод ядерного магнитного резонанса (ЯМР) также широко используется для рутинных измерений метаболома с преимуществом неразрушения образцов. Однако основным недостатком ЯМР является его относительно низкая чувствительность по сравнению с технологиями МС  [64]. Комбинированное применение методов масс-спектрометрии и ЯМР в метаболомике становится все более распространенным для всесторонних исследований метаболома и играет все более важную роль в раскрытии механизма заболевания и клинической диагностики  [65].

Анаэробную микробиоту можно выявлять с помощью хромато-масс-спектрометрии. М.Д. Ардатская и О.Н. Минушкин разработали способ определения короткоцепочечных (летучих) жирных кислот методом газожидкостной хроматографии (по метаболической активности микробиоты), которая позволяет быстро и достаточно точно выявлять содержание индигенной микробиоты, а также присутствие условно-патогенных и патогенных микроорганизмов в толстой кишке [3].

В последних исследованиях, посвященных анализу микробиоценоза кала, используется метод флуоресцентной гибридизации ДНК in situ (FISH). Количественный анализ бактериального состава и интенсивности свечения в центральных участках образца фекалий, на поверхности и в слизи позволили различить особенности биологической структуры кала здоровых и больных. Особенностью данных исследований является то, что исследуются не гомогенизированные образцы, а цилиндрические образцы кала, полученные от больных, так как при гомогенизации бактерии равномерно распределяются в образце, чего не бывает в естественных условиях [66].

В результате методов секвенирования следующего поколения, которые позволили проводить множественное параллельное секвенирование [67], метагеномика стала ключевым методом анализа микробиоты кишечника. В 2006 г. впервые сообщалось о применении этого метода к микробиому человека для анализа стула двух здоровых взрослых людей [68]. Четыре года спустя стал доступен генный каталог микробиома человека [69]. С тех пор участие кишечной микробиоты в физиологии и патологии человека продолжали изучать с помощью метагеномики. Метагеномика заключается в обнаружении всех компонентов образца с геномом путем секвенирования их генов без необходимости культивирования. Возможны два разных подхода. Целевая метагеномика основана на амплификации выбранной последовательности (часто области гена 16S) перед секвенированием и позволяет таксономически описать все бактериальные компоненты анализируемого образца. Метагеномика основана на секвенировании всей ДНК, присутствующей в образце, без априорного знания ее содержания и позволяет дать общее описание образца, включая бактерии, вирусы и паразиты.

В последнее время были предложены и апробированы скрининговые биохимические методы оценки состояния микробиоценоза кишечника по уровню протеолитической, Ig-расщепляющей активности супернатантов фекалий [70,71]. На кафедре микробиологии Тверского ГМУ модифицирован экспресс-метод диагностики дисбактериоза кишечника, принцип которого заключается в том, что при взаимодействии протеиназ бактериальных культур с казеином, содержащимся в агаровой среде, происходит его расщепление [72]. При добавлении коагулянта белка на мутном фоне агара выявляются зоны просветления вокруг лунок с казеинолитически активными микроорганизмами. Далее при использовании определенных критериев величины зоны просветления проводят оценку степени дисбиоза.

Микроорганизмы в процессе жизнедеятельности могут потреблять из внешней среды или выделять в нее различные вещества, в том числе простейшие по химической структуре газообразные соединения (оксид азота-NO, оксид углерода-CO, сероводород- Н₂S, водород -H₂, метан- СН₄, аммиак- NH₃ и другие), являющиеся разнообразными регуляторами внутри и межклеточной коммуникации, и динамика их концентрации в среде является важным физиологическим показателем. Сотрудниками кафедры микробиологии Тверского ГМУ во главе с Червинец Ю.В. получен патент на изобретение «Способ диагностики газового состава метаболитов микробиоты человека», позволяющий определить количество газовых сигнальных молекул, выделяемых микробиотой человека, с большой точностью и специфичностью, обладающего хорошей воспроизводимостью результатов, использованием минимального количества биомассы микроорганизмов в микрообъемах, отсутствием необходимости использования опасных химических реагентов [73]. Определение газовых сигнальных молекул (H₂, H₂S, N₂, O₂, NO, CO₂, CO, CH₄, C₂H₆, C₃H₈ и др.) проводится с помощью газовой хроматографии с применением газового хроматографа «Хроматэк-Кристалл 5000.2», оснащенного детектором по теплопроводности (ДТП), пламенно-ионизационным детектором (ПИД) и электронозахватным детектором (ЭЗД), подключенными последовательно, что обеспечивает одновременный анализ горючих и негорючих компонентов. Предлагаемый способ позволяет выявить закономерности между выделением газовых сигнальных молекул и различными заболеваниями (нервной, сердечно-сосудистой систем и др.). Данные газотрансмиттеры являются маркерами в диагностике, профилактике и лечении заболеваний различного профиля. Экономическая выгода очевидна вследствие раннего скрининга заболеваний нервной, сердечно-сосудистой систем, с последующим индивидуальным подбором программы ведения и методов профилактики, снижение затрат на реабилитацию при своевременном выявлении факторов риска появления данных заболеваний, отсутствия расходов на лечение осложнений заболеваний (инсульт, инфаркт, тромбоз).

Заключение

Человеческое тело полно обширного количества комменсальных микробов, состоящих из бактерий, вирусов и грибков, которые в совокупности называются микробиомом человека. Первоначальное приобретение микробиоты происходит как из внешней, так и из материнской среды, и подавляющее большинство из них колонизирует желудочно-кишечный тракт. Эти микробные сообщества играют центральную роль в созревании и развитии иммунной системы, центральной нервной системы и системы желудочно-кишечного тракта, а также отвечают за основные метаболические пути. Различные факторы, включая генетическую предрасположенность хозяина, факторы окружающей среды, образ жизни, диету, использование антибиотиков или неантибиотических препаратов и т. д., влияют на состав микробиоты кишечника. Причины, приводящие к развитию дисбиоза кишечника, широки и разнообразны.

Задача практикующего врача – выявить причинно-следственную связь не только в появлении разнообразных состояний у человека, но и в развитии последствий или осложнений как со стороны органов и тканей человека, так и его микробной экосистемы. Для поддержания здоровья, лечения и профилактики различных заболеваний человека и снижения риска их возникновения необходимо уделять большое внимание диагностике функциональной активности и количества нормальной микробиоты, влияющей как на поддержание состояния здоровья, так и на развитие разнообразных заболеваний. Использование пробиотиков, пребиотиков, постбиотиков и синбиотиков может принести потенциальную пользу для здоровья человека в плане укрепления и восстановления функциональной активности собственной нормобиоты.

Червинец  Ю.В.       - https://orcid.org/0000-0001-9209-7839;

Курмангалиева С.С. - https://orcid.org/0000-0002-9502-1490;

Зевалкина Е.В.          - https://orcid.org/0000-0001-6319-6547

Сарбулатова А.Ш.    - https://orcid.org/0009-0002-7811-5986

Алпамыс А.К.           - https://orcid.org/0009-0008-0088-9977

Жанаманова Р.Н.     - https://orcid.org/0000-0003-0911-3485

Список литературы

Дополнительные файлы